1 肠道菌群的分布与益生菌的定义

1.1 肠道菌群的分布

在动物消化道内存在着大约有30个属500多种微生物,可以分为专性厌氧菌、兼性厌氧菌和需氧菌3部分,属于专性厌氧菌的有拟杆菌(bacteroides)、梭状芽孢杆菌(clostridia)等,兼性厌氧菌有葡萄球菌(staphycococci)、肠道球菌(enterococci)、大肠杆菌(E coli)等。厌氧菌的数量远远大于需氧菌的数量,并且革兰氏阳性菌占主要部分(Macy等,1979),大部分为乳酸菌(乳酸杆菌、链球菌、消化链球菌等)和双歧杆菌(Macfalrane等,1994),另一部分为革兰氏阴性菌。通过无菌动物和正常动物的对照试验比较,肠道微生物对其寄主肠道在生化、生理和免疫等方面起着重要的作用

(Gordon等,1971;Luckey,1963;Tannock,1999)。

1.2 益生菌的定义

益生菌这个词起源于希腊,当时的意思为/pro life0。Lilly等(1965)把它定义为微生物体所产生的能够促进生长的物质,Parker(1974)认为/益生菌0是能够影响肠道微生物并且对动物产生有益作用的微生物。Fuller(1989)把它定义为通过改善动物肠道而对动物本身产生有益作用的活的微生物添加剂。Havenaar等(1992)把Full-er关于益生菌的定义进一步扩展,并且定义为:能够通过改善肠道微生物区系而应用于人和动物的单一或复合的活的微生物体的培养物。Tannock等(2000)更加强调微生物在胃肠道中的存活能力,并将其定义为/能够通过胃肠道,从而对人和动物健康有益的活的微生物0。研究结果表明:益生菌能迅速提高机体的抗病能力、代谢能力和对饲料的消化吸收能力,既防治消化道疾病又促进生长。

2 肠道生态系统失调

肠道生态系统失调通常是由于小肠内一些细菌在数量上的增加引起的,尤其是一些需氧菌的增加,大部分为肠杆菌科和链球菌属类细菌,另外,双歧杆菌和梭状芽孢杆菌属的减少也会造成肠道微生物失调(Mitsuoka,1992)。引起肠道生态系统失调的原因可以分为外源和内源2方面。外源包括:抗生素的使用、老龄化、外科手术、肝肾病、放射治疗、化学治疗、免疫系统失调以及应激等;内源方面包括日粮改变、营养水平变化、胃肠道pH改变、腹泻、细菌的颉颃、黏液素、融解酵素、抵御素的分泌等(Suskovic等,2001)。

3 益生菌对动物肠道生态系统的影响及作用机制

3.1 抑制肠道病原菌的作用

3.1.1 定植黏附作用

黏附能力通常被认为是病原菌的一种重要的毒性因子(Firday等,1997),致病菌与肠道黏膜表面受体结合粘附于肠道黏膜,是其定植并产生临床症状的前提条件。因此,许多益生菌可以通过与致病菌竞争肠上皮微绒毛上的脂质和蛋白质上的相同复合糖(glycoconjugate)受体来达到阻止致病菌的定植(李树鹏等,2004)。研究结果表明,益生菌可以黏附于微绒毛的刷状缘和黏膜层而不被肠蠕动冲走,并且参与其与致病菌之间生存与繁殖的时空竞争、定居部位竞争以及营养竞争,限制致病菌群的生存繁殖。不同的益胞的增殖并参与T淋巴细胞、CTL、NK细胞和LAK细胞的活化(Thomas等,1989)。用109CFU/ml嗜酸乳杆菌给小鼠灌胃8 h后取其腹膜巨噬细胞培养,所产生的INF-A数量明显上升(Tejada-si-mon等,1999)。双歧杆菌具有免疫赋活作用,能激活机体免疫系统中NK细胞和B淋巴细胞,另外还能激活机体单核巨噬细胞系统,促进巨噬细胞的吞噬和杀菌功能。其机理可能是双歧杆菌可易位进入血液循环,被单核巨噬细胞吞噬,从而激活单核巨噬细胞系统黏附方式不同,如L gasseri通过糖类和糖蛋白来黏附,而且其黏附力最强;嗜酸性乳杆菌依靠糖类、二价钙离子来黏附;双歧杆菌通过脂壁磷酸黏附于肠上皮细胞表面,构成一层菌膜屏障,并产生细胞外糖苷酶,降解上皮细胞上作为潜在致病菌及其内毒素结合受体的复杂多糖,竞争性抑制肠道内源性(主要肠杆菌科细菌)及外源性潜在致病菌(poten-tiallypathogenic microorganisms, PPMOs)对肠上皮细胞的黏附、定植,促使它们离开感染的肠道,从而起到定植颉颃作用(Fernandez等,2003)。

3.1.2 产生抑制病原菌的代谢产物

益生菌能够产生抑制病原菌的代谢产物,主要表现在以下几个方面:¹产生酸性物质:肠道内双歧杆菌、乳酸杆菌等有益菌可产生一些酸性代谢产物(如乙酸、乳酸、短链脂肪酸)能够降低局部pH,可抑制大肠杆菌及梭菌类的生长,抑菌率高达80%以上;º产生细菌素(bactericin):细菌素是一类选择性作用于细菌靶细胞的抗菌物质,它们大多属多肽类且具水溶性。如乳酸乳球菌产生的nisin细菌素、嗜酸性乳杆菌产生的细菌素、双歧杆菌产生的bifidin菌素以及从枯草芽孢杆菌中提取的枯草菌素(subticin),都能够起到抑菌或杀菌作用;»产生过氧化氢(H2O2):嗜酸乳杆菌、乳酸乳杆菌等在动物体内可产生过氧化氢,激活动物大肠内的过氧化物酶-硫氰酸盐反应系统,在此系统中,乳过氧化物酶与过氧化氢结合,然后将硫氰酸盐氧化成氧化性中间产物,抑制葡萄球菌等致病菌的生长繁殖(马现永等,2002);¼产生诱导酶:双歧杆菌和某些乳杆菌产生胞外糖苷酶,可降解肠粘膜上皮细胞的复杂多糖,由于这些糖是致病菌和细菌毒素的潜在受体,通过酶的作用,可以阻止毒素对上皮细胞的粘附和侵入;½产生双乙酰(丁二酮):乳酸菌的各个属在糖代谢时都可产生双乙酰,这种化合物对许多病原菌有抑制作用(楚渠等,2004)。另外,乳酸菌本身还具有抑制病原体复制的作用(Alvarez等,2001)。

3.2 对肠道的营养作用

乳酸菌提高乳糖酶活性,缓解乳糖消化不良。还有研究结果表明,益生菌能够降低一些具有致癌性质的结肠酶(如葡萄糖苷酸酶、葡萄糖苷酶、硝基还原酶、氮基还原酶、类固醇-7-脱氢羟化酶)的活性(Rowland,1992)。益生菌还能直接产生多种营养物质如维生素、氨基酸、短链脂肪酸、促生长因子等,参与动物体的新陈代谢,有的微生物在动物体内生长繁殖时能合成核黄素、泛酸、叶酸、VB12等B族维生素,参与机体某些重要的代谢反应。

3.3 益生菌增强动物免疫力的机理

3.3.1 益生菌制剂中具有免疫调节作用的活性成分

革兰氏阴性菌细胞壁含有细菌肽聚糖(PG),细菌脂多糖(LPS)和多糖(PS),阳性菌还含有脂磷壁酸(LTA),这些大分子成分是细菌对宿主发挥生理功能的主要物质基础。Kopp等(1999)认为细菌脂多糖和细菌肽聚糖可通过信号传导通路刺激巨噬细胞、内皮细胞、嗜中性粒细胞产生介质,如肿瘤坏死因子、IL-1、IL-6、IL-8、IL-12等,对介导非特异性免疫起重作用。另外,Rowland等(1975)发现双歧杆菌分泌一种降解N-亚硝胺的酶,使亚硝胺分解,预防其引起的肿瘤产生。3.3.2 体液免疫 乳酸杆菌和双歧杆菌的代谢物和整个细胞等抗原物质能通过M细胞进入PP,激活Th2细胞,产生大量的IL-5,而IL-5是有效的IgA产生因子,能激活PP生发中心的B细胞,使其转化为浆细胞,在生产Ig的过程中向IgA转化,从而使得SIgA水平上升。SIgA是黏膜体液免疫的主要效应因子,它能预防肠道蛋白酶的分解,形成黏膜上的抗体。它经肠黏膜上皮细胞释放到肠腔内与肠黏膜表面的正常菌群混合存在,其在外分泌液中以双链和四链的形式存在,具有多链性、粘膜亲和性

与抵抗蛋白酶作用的特性,比单链IgA更有抗原结合力,与IgA和IgG相比,SIgA可以从空间构象上阻止细菌的附着,从而中和细菌毒素,限制细菌的繁殖,维持肠道内的正常菌群平衡,在局部抗感染过程中起关键作用(李树鹏等,2004)。当SIgA抗体分泌增强时,提高免疫识别力,并诱导T、B淋巴细胞和巨噬细胞等产生细胞因子,通过淋巴细胞再循环而活化全身免疫系统从而增强机体的免疫功能。Yasui等发现短双歧杆菌可激活小鼠体液免疫系统,提高抗轮状病毒IgA或抗流感病毒IgG产生,乳酸双歧杆菌能增强小鼠对鼠伤寒沙门氏菌、大肠埃希菌O157H7感染的抵抗力,特异性IgA抗体升高(蓝景刚等,2002)。

3.3.3 细胞免疫

研究结果表明,益生菌能激活肠黏膜中巨噬细胞、T细胞和NK细胞的功能,增强机体免疫应答。活性酵母能够提高免疫机能可能与其胞壁物质(即B-葡聚糖和磷酸化甘寡糖)和胞内活性肽有关(Indegrrew,1999),B-葡聚糖能提高动物细胞免疫能力,可能归因于添加后刺激网状内皮细胞发育,导致巨噬细胞大量增生,后者通过噬菌作用破坏微生物和抗原的入侵(Macdonald,1995)。乳酸菌能够激活巨噬细胞、B淋巴细胞和NK细胞,增加IL-1、IL-2、IL-6、IL-5、TNF-a等细胞因

子的产生量。其中IL-6和TNF-a是被激活的巨噬细胞分泌的2种重要的细胞因子,IL-6可以促进营养与饲养#动物肠道内存在着大量的微生物群系,类型不同,含量多少不一,这些微生物与宿主之间既有正向关系(偏利共生、相生和互惠现象),也有负向关系(竞争、偏害现象),共同维持着微生态平衡。然而,近年来抗生素作为饲料添加剂的大量使用,在抑制

和杀灭病原菌的同时也抑杀了动物机体内正常共生的菌群,破坏了微生态平衡。相反,益生菌的作用在于扶植正常微生物菌群,颉颃病原菌,把生态失衡调节为生态平衡。作者主要在益生菌对动物肠道微生态学的影响方面进行了综述。

4 益生菌制剂的合理应用

4.1 益生菌制剂所使用的微生物菌种及分类

我国目前允许使用的饲料级微生物菌种有15种。优良菌种需具备的条件有:¹对动物和人体无毒、无害、安全和无副作用;º具有存活能力并能进行工业化规模生产;»经加工后活菌存活率高、稳定性好;¼有利于促进宿主的生长发育及提高抗病能力。目前常用的益生菌种类主要有:¹乳酸菌(lac-tic acid bacteria):乳酸菌是一类可以分解糖类产生乳酸的细菌的总称。目前已发现的这类菌在细菌分类学上有18个属,其中有益菌以乳杆菌属、双歧杆菌属为代表,已被证实在临床上能够治疗和预防人和动物的某些肠道疾病或起保健作用(黄庆生等,2002)。º芽孢杆菌(bacillus):芽孢杆菌是一类好氧

菌,在一定条件下产生芽孢。目前使用的菌株有枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌、东洋芽孢菌等。»酵母菌(yeast):饲用酵母的种类主要有热带假丝酵母、产阮假丝酵母、啤酒酵母、红色酵母等。

4.2 益生菌制剂的安全性

益生菌安全性评价一般以病原性、毒性、代谢活性及菌株内在特性作为指标。现在多采用无特定病原和无菌动物来研究菌株的病原性及毒性,关于益生菌代谢活性安全性研究主要集中在它们是否产生氨、胺、吲哚、苯酚、致癌亚胆酸及降解黏膜的酶类上(Cheah,1990),通过细胞凝集活性来评价细菌表面特性。虽然目前对益生菌安全性并没有公认的解释,但综合目前对益生菌的研究,对益生菌安全性可以获得如下的认识:益生菌一定不能是致病菌而且不能产生有害物质,菌株不能通过遗传修饰获得有害基因或具有把有害基因转移的潜力(袁铁铮等,2004)。

5 小结

综上所述,益生菌能够从肠道微生态角度提高乳酸菌、双歧杆菌等有益菌的含量,维持肠道正常的有益菌数量,抑制病原菌,这对动物机体具有防治消化道疾病和促进生长的双重作用。随着畜牧学生物技术的发展,近年来对于益生菌的应用效果已得到了公认,但是在益生菌的研究还存在诸多难点,如:目前除对一些乳酸菌和酿酒酵母的研究相对深入一些外,大部分益生菌的作用机制尚未清楚。因此急需加强力量对益生菌的作用机理进行更加深入的研究,以指导益生素的研制、生产及使用。

参考文献

1 Alvarez O M I,Oberhelman R A.Probiotic agents and infectious-disease:a modem perspective on a traditional thempy[J].Clin In-fect Dis,2001,32(11):1567~1576.

2 Fernandez M F,Boris S,Barbes C.Probiotic properties of human-lactobacili strains to be used in the gastrointestinal tract [J].JAppl Microbiol,2003,94(3):449~455.

3 Firday B B,Falkow S.Common themes in microbial pathogenicityrevisitied [J ]. Microbiology and Molecular Biology Reviews,1997,61:136~169.

4 Indegrrew W M.Yeast:could you have a business onthisbug[A].In:BiotechnologyintheFeedInduxtry [C].Nottingham UniversityPress,Loughborough Leics UK, 1999,15,27~50.

5 Kopp E,Ruslan M,James C,et al. ECSIT is an evolutionarilycons erved intermediate in the TolIILi signal transduction path-way[J].Ge Nes Dev,1999,13:2059~2071.

6 Macdonald F.Use of immunostimulants in agricultural applica-tions[A].In:Biotechnology in the Feed Industry[C].NottinghamUniversity Press,Loughborough Leics UK, 1995,11,257~267.

7 Macfalrane G T, G R Gibson. Metabolic activities of the normalcolonic flora. In: Human Health: The Contribution of Microor-ganisms, S W Gibson (Ed), Springer-Verlag, London, 1994,17~52.

8 Mitsuoka T. The human gastrointestinal tract. In: The LacticAcid Bacteria in Health & Disease, B. J. B. Wood (Ed.),Elsevier Aplied Science, London,1992,69~114.

9 Rowland I R. Metabolic interactions in the gut. In: Probiotics.The Scientific Basis, R. Fuller (Ed.), Chapman & Hall, Lon-don,1992, 29~54.

10 Suskovic J, et al. Lactic Acid Bacteria and Bifidobacteria in Syn-biotic Effect. Food Technol Biotechnol, 2001, 39 (3): 227 ~235.

11 Tagg J R,Dierksen K P.Bacterial replacement therapy:adapting-germ warfare to infection prevention[J].Trend Biotech,2003,21(5):217~223.

12 Tannock G W. A fresh look at the intestinal microflora. In:Probiotics: A Critical Review, Horiozon Scientific Press,Wymondham,1999, 5~14.

13 Tannock G W, Munro K, Harmsen H J M,et al. Analysis ofthe fecal microflora of human subjects consuming a probiotic product containing Lactocillus rhamnosus DR20. Applied and Environmental Microbiolofy, 2000,66:2578~2588.

14 Tejada-simon M V, Lee J H, Ustunol Z,et al.Ingestion of you-gurt containing lactobacillus and bifidobacterium to potentiateimmunoglobulin a responses to cholira toxin in mice[J].Journalof Dairy Science,1999, 82:649~660.